Protein A ELISA Kit Performance Summary
INTRODUCTION
Protein A ELISAキット（カタログ番号9000-1）は、残留したネイティブおよび組換えProtein A（rPA）の検出と定量を目的としています。当社のProtein A ELISAキットは、抗体産生中の少量の汚染Protein Aを測定するために高感度アッセイを必要とするお客様向けに開発されました。Protein A汚染の試験は、次のような開発および商業製造のいくつかの異なる段階で行われます。
- 特定の条件下での樹脂の浸出特性のプロセス開発
- 製造。通常は、精製プロセスのいくつかのポイントを通して採取された溶出サンプルから採取されます
- 製品リリースを終え、プロセスの封じ込めレベルとロット間の一貫性を文書化
以下の概要レポートには、ヒト免疫グロブリンG（hIgG）の存在下でのProtein A ELISAキットの評価から収集された性能データが含まれています。ここに示すデータは、Protein A ELISAキットの以下の内容を示すものです。
- PBS-Tバッファー中の最大0.5 mg/ml hIgGの存在下でrPAを検出する能力
- 回収率（精度）、インターアッセイおよびイントラアッセイの精度、定量限界、検出限界
RESULTS SUMMARY
hIgG存在下のrPA
Protein A ELISAキットの性能は、hIgGの存在下でrPAを検出する場合に、hIgGを含まない標準品と比較して評価しました。スパイクされたすべてのサンプルの最終hIgG濃度は0.125 mg/mlでした（アッセイプレートへの最終希釈後）。各サンプルは8個ずつ複製して調製し、キットの標準プロトコールに従って3回のELISAを実施しました。
データ処理
標準曲線データポイントは4つのパラメータフィット分析をあてはめました。この式により、サンプルrPA濃度の逆計算とLoQ値の計算が可能になりました。回収率は、次のように計算されました。
イントラアッセイ精度
表1.標準曲線サンプルのイントラアッセイ精度 （hlgGなし）
| 濃度（ng/ml） | 平均% CV |
|---|---|
| 1.6 | 3.7 |
| 0.8 | 3.5 |
| 0.4 | 4.7 |
| 0.2 | 6.8 |
| 0.1 | 4.6 |
| 0.05 | 8.6 |
表2.hlgGを含むサンプルのイントラアッセイ精度
| 濃度（ng/ml） | 計算濃度 | 平均% CV |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 3.9 |
| 1.0 | 0.91 | 3.5 |
| 0.8 | 0.74 | 2.6 |
| 0.6 | 0.54 | 3.9 |
| 0.4 | 0.35 | 3.4 |
| 0.2 | 0.19 | 8.7 |
| 0.1 | 0.11 | 10.4 |
| 0.05 | 0.06 | 17.7 |
インターアッセイ精度
表3.標準曲線サンプルのインターアッセイ精度 （hlgGなし）
| 濃度（ng/ml） | 平均% CV |
|---|---|
| 1.6 | 3.3 |
| 0.8 | 3.2 |
| 0.4 | 4.9 |
| 0.2 | 1.6 |
| 0.1 | 4.1 |
| 0.05 | 2.1 |
表4.hlgGを含むサンプルのインターアッセイ精度
| 濃度（ng/ml） | 計算濃度 | 平均% CV |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 1.3 |
| 1.0 | 0.91 | 0.9 |
| 0.8 | 0.74 | 0.8 |
| 0.6 | 0.54 | 0.4 |
| 0.4 | 0.35 | 1.0 |
| 0.2 | 0.19 | 3.1 |
| 0.1 | 0.11 | 4.9 |
| 0.05 | 0.06 | 5.1 |
精度
表5.標準曲線サンプルの精度
| 濃度（ng/ml） | 平均回収率% |
|---|---|
| 1.6 | 100 |
| 0.8 | 100 |
| 0.4 | 100 |
| 0.2 | 101 |
| 0.1 | 101 |
| 0.05 | 93 |
表6.hlgGを含むサンプルの精度
| 濃度（ng/ml） | 計算 濃度 |
平均修復% |
|---|---|---|
| 1.2 | 1.08 | 90 |
| 1.0 | 0.91 | 91 |
| 0.8 | 0.74 | 92 |
| 0.6 | 0.54 | 90 |
| 0.4 | 0.35 | 87 |
| 0.2 | 0.19 | 93 |
| 0.1 | 0.11 | 106 |
| 0.05 | 0.06 | 125 |
定量限界（LoQ）
標準曲線から決定されたLoQは0.037ng/mlと計算されました。hIgGの存在下でのrPA添加サンプルのLoQは、0.102 ng/mlまたは0.82 ng/mg（0.82ppm）でした。免疫グロブリンの存在下でrPA50リガンドを検出する際のキットの感度は < 1 part per million（ppm）または 0.1ng/mLでした。
希釈の直線性
Figure 1.
希釈グラフの直線性は、試験された濃度の範囲全体にわたる精度の高い相関関係を示すグラフです。
CONCLUSIONS
アッセイ内データによると、標準曲線サンプルの精度は許容範囲内で、%CV値は3.5～8.6%でした。標準曲線から求めたLoQは0.037ng/mlでした。
アッセイ内データは、サンプルは相対的な精度と正確さでアッセイされたことを示していました。算出されたLoQは0.102ng/mlでした（Protein A ELISAキットの感度は0.1ng/ml）。この限界値と同じかそれ以上の濃度のサンプルはすべて、%CV値が10.4～2.6%でした。15％の限界値を下回っています。
平均回収率%による測定精度は、標準では93- 101%、サンプルの場合は90-125%でした。
インターアッセイのデータにより、データが再現可能であることが示されました。%アッセイ間の変動係数は、すべての標準濃度で4.9%以下でした。サンプルは、インターアッセイの精度も高く、5.1-0.4%の範囲の%CV値がLoQ以上の濃度の場合に観察されました。
EXPLANATION OF CALCULATIONS
精度（%CV）
精度は、rPA添加サンプルデータポイント間の標準偏差を決定し、平均値で割ることによって計算されました。「業界ガイダンス: 生体分析方法検証」テキストによると、精度は15%以内でなければなりません。
イントラアッセイ精度
イントラアッセイ精度は、すべてのアッセイで%CV値を平均することにより、rPA添加サンプル濃度ごとに計算されました。
インターアッセイ精度
3つのアッセイの各計算結果間の標準偏差を決定し、次に平均値で割ることにより、各濃度点についてインターアッセイの精度を計算しました。
定量限界（LoQ）
定量限界（LoQ）は、0 ng/mlサンプルの標準偏差を10倍と定義されました。0 ng/ml OD値の標準偏差に10を掛けてから、ベースの0 ng/mlのOD値に加算しました。次に、LoQは、合計値を標準曲線4-パラメータ適合式に入力することによって生成されました。各キットについて、LoQは、バッファー1 mlあたりのProtein A ng（ng/ml）、およびhIgGの存在下で実行されたrPA添加サンプルのhIgG 1 mgあたりのProtein A（ppm）として報告されました。
検出限界（LoD）
検出限界（LoD）は、0 ng/ml Protein Aサンプルの標準偏差の3倍として定義されました。0 ng/ml OD値の標準偏差に3を掛けてから、ベースの0 ng/mlのOD値に加算しました。次に、LoQは、合計値を標準曲線4-パラメータ適合式に入力することによって生成されました。各キットについて、LoDはProtein A ng/mlバッファー（ng/ml）およびparts per million（ppm）として報告されました。
精度
精度は、理論上のスパイク濃度と比較した、アッセイによって決定された回収率として説明されます