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よくある質問

よくある質問 | 灌流

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灌流は、細胞を細胞培養バイオリアクター中に保持しつつ、バイオリアクター中の培地を除去し、同時に等量の培地を投入する手法です。これにより、フレッシュな栄養素を安定的に供給しつつ、細胞廃棄物を連続的に除去することが可能です。灌流は一般的に、従来型のバイオリアクターバッチ条件やフェッドバッチ条件よりもはるかに高い細胞密度を達成するために使用されます。これにより、より高い容量生産性を達成することが可能です。分泌されたタンパク質生成物は、培地を除去するプロセス中に精密ろ過によって連続的に採取することも、培地を除去するプロセス中に、適切に選択された限外ろ過を用いてバイオリアクター中に保持することもできます。

XCell ATF®システムのような、GMP準拠の既存の灌流デバイスを利用できるため、灌流は製造プラットフォームとして実行可能かつ認められています。1990年以降、灌流ベースのプロセスを使用して製造された市販の製品は数多くあります。こうした製品には、血液凝固因子(バイエル薬品の第VIII因子製剤であるコージネイトやワイス/ファイザー社のReFacto)、抗体(セントコア/J & J社のレオプロ、レミケード、Stelera、およびSimphoni、ジェンザイム社のキャンパス)、酵素(バイオマリン社のアウドラザイムおよびナグラザイム)などがあります。

高い生細胞密度(VCD)、生存率、生産性を達成することで、生成物の品質を向上させることが可能です。また、生産プロセスに複数の形で影響を与え、経済的効率を大幅に向上させることができます。細胞培養灌流を導入してプロセスを改善する方法の例には、以下のものがあります。

  • 生産、採取を連続的かつ同時的に行う:この手法では、高細胞密度培養(40~80E6 cells/mL以上)を維持し、通常で30〜90日間、連続して生成物を採取します。これにより、比較的小さなバイオリアクターで、一貫した品質、効率的な生産を実現できます。
  • 高密度播種のバンク: 灌流により高密度で調製された懸濁液培養では、細胞増殖の開始を早めるために、均一な特性を持つ大量の細胞をバンクしておくことができます。灌流では、これらの細胞を高い生存率を維持しながら目的のVCDで対数増殖期にバンクできます。
  • N-1灌流シードバイオリアクター(プロダクションバイオリアクターの播種密度が高い場合):このアプローチでは、灌流を使用して、製造プロセスの最後から2番目のバイオリアクターで細胞密度を上げ、プロダクションバイオリアクターの種菌の細胞密度を向上します。これにより、最終的な生産プロセスを変更することなく、プロダクションバイオリアクターで数日の時間を節約でき、年間スループットが向上します。
  • 高濃度フェッドバッチ:このプロセスでは、限外フィルターを使用してバイオリアクター内に生成物を保持しつつ、細胞懸濁液からの廃棄物を灌流します。この培養はフェッドバッチのように短時間で行われます。また、従来型のフェッドバッチと比較して、細胞密度および生成物の力価が5~10倍高くなります。
  • 細胞のクラリフィケーション: フェッドバッチまたは濃縮フェッドバッチ灌流では、XCell ATF®精密ろ過を使用して生成物の採取を行うことで、採取のクラリフィケーションで従来から採用されてきた、面倒な連続遠心分離や連続デプスフィルターが不要になります。

上記の各プロセスにより、製造現場での大幅な節約が可能になります。これらの各プロセスを評価することで、プロセス、資本設備のコスト削減を決定できます。これは、灌流の導入時に達成できます。

はい、灌流をはじめて導入するクライアントが、灌流の初期段階で既存の基礎培地から始めることはよくあります。細胞密度が増加するごとに、既存の基礎培地と既存の濃縮フィード(栄養素の消費量に基づいて滴定)を組み合わせたものを投入します。培地の相対的な消費は、灌流速度を変化させることで緩和できます。最終的な目標は、培地組成と最大の灌流速度のバランスを見つけることです(この灌流速度は、ダウンストリームの処理機能、採取物保管機能、細胞分離デバイスと連携したものです)。

定常状態の灌流におけるグルコース濃度は低いことが理想的です。細胞は、過剰なグルコースにさらされたときに代謝が非効率的になる可能性があり、その結果ラクテートの生産が促される可能性があります。そのため、残留グルコースを低レベル(0.1~0.5 g/L)に制御することを推奨します。フェッドバッチプロセスとは異なり、新鮮な培地からのグルコースの継続的な供給があるため、灌流中にグルコースが完全に枯渇することはまずありません。ですが、非常に高い細胞密度では、培地に存在するグルコースが十分でなくなる可能性があります。この場合、グルコースの連続的な供給を追加で行うことで、培地中のグルコースレベルを増加させることができ、また場合によっては灌流速度を増加させることもできます。

フェッドバッチに適したインペラは灌流にも使用できますが、大規模なバイオリアクターにはデュアルインペラ構成をお勧めします。マリンインペラやRushtonインペラの組み合わせが最適な場合もあります。どのインペラ構成がお客様のプロセスに最適かは、kLa調査を行うことで決定できます。

高密度細胞培養では、マイクロスパージャーの使用が推奨されます。マイクロスパージャーでは、穴あき型のチューブスパージャーよりも小さな気泡を生成できます。そのため単位体積あたりの表面積が高くなり、kLaが増加します。ですが、小さい気泡は安定性が高くなるため、著しいCO2の蓄積が発生する可能性があります。また、気泡が小さいと、破裂時に放出されるエネルギーが多くなり、細胞に損傷を与える可能性があります。

マイクロスパージャーを、穴あき型のチューブスパージャーと組み合わせて、それぞれ別個の目的で使用することを推奨します。マイクロスパージャーは、(ガススループットを最小限に抑制する目的で)O2のスパージにのみ使用します。一方、穴あき型のチューブスパージャーは、C02の蓄積を最小限に抑制する目的で、空気またはO2のスパージに使用します。また、大きな気泡の存在により、マイクロスパージャーで生成されたフォームパックが不安定になる傾向があります。

フェッドバッチにおけるバッチと同様に、pH管理を行うために塩基を使用する必要があります。一般的なものとしては、炭酸ナトリウム(Na2C03)、炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)、水酸化ナトリウム(NaOH)が使用できますが、他のプロセスで使用される塩基を使用することもできます。炭酸ナトリウムは水酸化ナトリウムより穏やかですが、炭酸ナトリウムが炭酸イオンに解離して浸透圧の増加が生じます。pCO2と浸透圧は、高細胞密度において複合されます。そのため、pCO2に影響せず、炭酸ナトリウムよりも浸透圧に及ぼす影響が少ないNaOH(0.3~0.7 M)の使用が一般的です。ですが、NaOHは強力な塩基であるため、局所的な細胞の損傷を防げる手法でシステムに投入する必要があります。すなわち、最も効率よく混合を行える箇所に投入する必要があります。すぐに消散するように、上部インペラの真上から直接投入する必要があります。

バイオリアクターの処理容量を一定に保つためには、採取速度を事前に定められた灌流速度と等しくする必要があります。また、レベルの変化を防ぐために、供給速度を採取速度と同じにする必要もあります。

容量は、さまざまな方法で制御できます。

最も簡単な方法は、採取ポンプと供給ポンプのポンピング速度を、所定の灌流速度に統一することです。これは、デュアルポンプヘッドを備えたポンプを1台使用することで達成できます。この手法は、ブリードがなく、塩基が投入されていない場合に有効です。

また、供給ポンプを制御するフィードバックループでレベルを測定するコンダクタンスプローブを使用する方法もあります。レベルは、このレベルプローブの先端で測定されます。採取ポンプが使用済みの培地を除去して液面が低下し、プローブの導通が切断されると供給ポンプが作動します。この際、プローブの導通が回復するまで培地が供給されます。注:泡が過剰に蓄積すると、不正確なレベルが出力される可能性があります。可能であれば、レベルプローブの感度を調節して泡の影響を抑制してください。

重量ベースのコントロールが、レベルを制御するための最も正確な方法です。このセットアップでは、バイオリアクターはフィードバックループのポンプと接続されたスケール(またはロードセル)上に設置されます。このレベル制御ループは、1)バイオリアクター制御ループで供給ポンプに接続されたスケール、または2)別のスマート供給ポンプ(SciLog ChemtechポンプCP-120)に直接接続されたスケールのどちらかです。灌流を開始する準備ができたら、バイオリアクターまたはスマートポンプのレベル制御ループを開始するだけです。採取ポンプが培地を取り除き、重量が所定の設定値を下回ると、供給ポンプがトリガーされて重量が設定値のレベルまで戻ります。

細胞特異的灌流速度(CSPR)は、灌流速度を細胞密度で除した値です。理想的なCSPRがどの程度かは、細胞株や培地に依存します。CSPRを理想的なものにすれば、最適な成長速度、生産性を達成できるはずです。50~100 pL/cell(1日あたり)の範囲から始めることが妥当です。これを調整して、細胞株ごとに最適な速度を見つけることができます。CSPRを低くすれば、培地の使用量を減らし、力価を上げることができます。ただし、CSPRは製品品質に影響を与えることが示されています。そのため、生成物の品質という観点で、理想的なCSPRを決定することが重要です。

  1. 細胞密度が0.3-1E6 cells/mLの細胞をバイオリアクターに接種し、バッチモードで培養を開始し、細胞密度が2-4E6 cells/mLに達したら0.5-1 VVDで潅流を開始します(細胞がまだ指数増殖期にある間に灌流を開始することが重要です)。
     
  2. 灌流速度を段階的に2 VVD(成長が遅くなる場合はそれ以上)まで増加させながら成長速度を毎日モニタリングし、細胞を指数関数的に成長させ、20E6 cells/mLに到達するまで待ちます。
     
  3. 細胞成長を相殺する量のセルブリードを毎日行うことで指数増殖期の細胞の密度を20E6 cells/mL程度に保持し、定常状態の培養を確立します。
     
  4. 次の手順を1~3日間隔(加えた変更の影響を観察するために必要な期間)で行い、所定の細胞株、培地における最小CSPRを特定します。
     
  • 灌流速度を0.5 VVD刻みで、i)またはii)まで結果に応じて増加させます。i.(灌流速度を上げたときに)成長速度が増加した場合、現在のCSPRはまだ低すぎます。灌流速度を上げても成長速度が上がらなくなるまで、灌流速度を0.5 VVD刻みで繰り返し増加させます。最後の増加からもう1段階増加した値が、CSPRの最小値です。
     
  • (灌流速度を上げたときに)成長速度が増加しなかった場合、現在のCSPRは十分です。CSPRの最小値はより低いものである可能性が高いです。これを確かめるために、成長速度が低下するまで灌流速度を0.2 VVD刻みで減少させます。成長速度の低下が確認される1段階前の灌流速度が、最小CSPRになります。(注:成長速度の低下が確認された後、培養が栄養制限から回復するために数日かかる場合があります。)

*注:CSPRの最小値を決定したら、生成物の品質を確認することを推奨します。

通常は、バッチ培養で培養を開始します。灌流は通常、細胞がまだ指数増殖期にある接種後2~3日目、栄養制限が発生する前に開始されます。

灌流の開始日はプロセスに依存します。また、細胞株、接種細胞密度、細胞成長速度、代謝、培地によって異なります。1つの方法として、フェッドバッチプロセスにおける最初の供給が行われたときに、灌流を開始する方法があります。2〜3日目にXCell ATF®システムでの灌流を開始して、灌流機器(ポンプ、レベルコントロールなど)のチェック/モニタリングを行い、灌流速度などの設定を調整することが推奨されます。

灌流速度を上げる方法は複数あり、段階的(手動)または連続的(自動)に上げる方法があります。段階的な手法はオペレーターにより行われます。細胞密度や、培地中に存在するグルコースなど、栄養消費のバイオマーカーに基づいた決定ができます。グルコースレベルが、中程度の養分可給性を示す適当なバイオマーカーである場合は、バイオリアクター内のグルコース残留濃度を参考にして灌流速度を調整できます。段階的に灌流速度を上げる場合、通常は0.5または1 VVDから開始し、残留グルコース濃度や細胞密度に応じて、0.5または1 VVDずつ増加させます。細胞密度、成長速度、特定のグルコース消費量を参考に、残留グルコースを予測します。灌流速度を連続的に上げる場合は、バイオマスプローブ(Aberプローブなど)を採取ポンプに接続し、理想的なCSPRを参考にして、バイオマスプローブで測定された細胞密度と比例するように灌流速度を増加させます。

灌流速度は細胞密度や培地に依存します。理想としては、栄養素の投入速度と副生成物の除去速度を適切なものに維持しつつ、目的の生成物の希釈を抑制するために(収穫力価を最大化するために)、灌流速度を最小限に抑える必要があります。灌流プロセスは通常、1~5 VVDの範囲で行われます。液体の取り扱いや培地コストの観点から言えば、低い灌流速度が理想です。非常に高い細胞密度を達成する、POI(対象のタンパク質)の滞留時間を短縮するなどの場合に、高い灌流速度が必要になる場合がありますが、液体処理の点でより困難になります。ただし、プロセスが高い灌流速度に依存している場合でも、追加の別のXCell ATF®システムで、限外ろ過メンブレンを使用してサージタンクから生成物を濃縮することで、取り扱いを容易にすることができます。

定常状態とは、細胞密度とバイオリアクターの環境が比較的一定に保たれている状態を指す用語です。これは、セルブリードや栄養制限で達成できます。また、温度を下げることによって達成できることもあります。栄養制限で生産性が影響を受けたり、製品の品質が変化したりする場合は、セルブリード法を用いることを推奨します。XCell ATF®灌流システムで栄養供給と廃棄物の除去を行うことで、連続的な細胞成長、生産性を実現できます。

これは培地、細胞株、プロセスにより異なります。灌流速度1VVDでは、一般に20~30E6 細胞/mLの細胞密度をサポートします。細胞密度を高めるには、灌流速度を高めるか、灌流で使用する培地を最適化する必要があります。ただし、細胞密度が高すぎると、バイオリアクター内での制御が難しくなる場合があります(pCO2、浸透圧、泡など)。そのため、生産性を高いまま維持できる、管理可能な細胞密度で安定した状態を保つことをお勧めします。

セルブリードとは、単にバイオリアクターから細胞を取り除くことです。セルブリードは通常、浸漬チューブを介して、一定流量で動作する蠕動ポンプを使用して行われます。チューブは慎重に選択する必要があります。狭すぎると細胞が凝集して詰まる可能性があり、広すぎると細胞が沈降する可能性があります。セルブリードの速度は成長速度に基づいて決定できるため、細胞密度を連続的に目的の値まで抑制することができます。また、1日に1回細胞を取り除き、培地と交換することで、細胞密度を予測可能な範囲内に維持することもできます。

安定した細胞密度を維持するために、セルブリードの速度を成長速度と等しくすることが理想的です。セルブリードで貴重な生成物が大量に除去される場合は、ブリードを滅菌バッグで回収し、ろ過や遠心分離でタンパク質を分離して、ダウンストリームで処理します。

灌流培養は高い細胞密度で行われるため、泡の発生が追加の問題になる場合がありますが、消泡剤を使用して泡を制御することができます。

消泡剤は、(フェッドバッチと同様に)適宜まとめて手動で投入することも、フォームプローブを使用して自動で投入することもできます。フォームプローブはコンダクタンスプローブであり、液面より上に配置されます。液体表面の泡が増加し、フォームパックがフォームプローブに接触するまで上昇すると、導通が形成されます。これは、泡が消散して導通が切断するまで消泡剤を投入するポンプをトリガーするために使用できます。(注:フォームプローブはレベルプローブですが、逆の用途で使用されます。)

プロセス中で消泡剤が使用できない場合には、効率的な酸素移動(kLa)を達成するための手段を最適化することで、泡を最小限に抑えることができます。フェッドバッチと同様に、エアレーションメカニズムを変更して気泡を最小限に抑えることができます。これは、インペラ構成と速度の最適化、マイクロスパージャーによるO2のみの散布、焼結スパージャーの細孔サイズの最適化などで達成できます。(特にマイクロスパージングにおいて)高純度のO2散布を行う場合、培地中の二酸化炭素レベルに特に注意する必要があります。注:気泡の発生の問題は、スケールが小規模な場合のほうがより悪化します。スケールが大規模な場合は、気泡の滞留時間と分圧がバイオリアクターの高さに応じて増加します。

メンブレン表面に消泡剤が付着し、メンブレンの特性が変化することが予想されます。多少のタンパク質の滞留を引き起こし、実行日数によってはメンブレンが汚れてしまうこともあります。透過液の流れの圧力を観察して汚れが確認できた場合は、フィルターを交換できます。